Tochter eines jüdischen Berliner Kaufmanns, sie studierte Kunstgeschichte, Alte Geschichte und Archäologie in Berlin, Freiburg, München und Rostock. Seit 1927 schrieb sie Kritiken und Reportagen für den Film-Kurier, die damals renommierteste deutsche Filmzeitschrift.

1933 emigrierte sie nach Frankreich. In Paris schrieb sie für deutschsprachige Monatszeitschrift Die Kritik und die antifaschistische Internationale Filmschau. Gemeinsam mit Henri Langlois und Georges Franju, die eine Cinematheque Francaise gründen wollten, sammelte sie Dokumente zur Geschichte des Films. Nachdem die deutschen Truppen im Jahr 1940 Frankreich besetzt hatten, musste sie sich verstecken, sie wurde aber aufgespürt und im Konzentrationslager Gurs in Südfrankreich interniert.

Von 1945 bis 1975 war sie Chefkonservatorin der Cinémathèque Française. Hier machte sie sich besonders um den Aufbau des Filmmuseums verdient, für das sie in der ganzen Welt Kostüme, Fotos, Drehbücher Ausstattungsgegenstände, Kameras und vieles mehr zusammentrug. Das Museum wurde im Juni 1972 im Palais de Chaillot in Paris eröffnet. Daneben schrieb sie gelegentlich Artikel in Filmzeitschriften wie den Cahiers du cinéma und La Revue du Cinéma. Bekannt ist Eisner vor allem durch ihr Buch Die Dämonische Leinwand, über den expressionistischen deutschen Stummfilm.

Neben Siegfried Kracauers Werk wurden die Schriften Lotte Eisners zu einem wichtigen Anknüpfungspunkt für einen Neubeginn anspruchsvoller Filmkritik in den 50er Jahren, der zur Gründung der Zeitschrift Filmkritik führte. Eisner hielt auch persönlich Kontakt zu den jüngeren Filmkritikern und reiste zu den Filmclubtreffen in der französischen Besatzungszone und nach Münster, wo es das erste ständige Filmseminar an einer deutschen Universität gab. Dabei brachte sie Filmkopien mit. Eisner setzte sich seit den 60er Jahren sehr für die Regisseure des neuen deutschen Films ein und wurde von diesen als eine Art geistige Mutter verehrt. Wim Wenders würdigte Lotte Eisner durch die Widmung seines bei den Internationalen Filmfestspielen von Cannes 1984 mit der Goldenen Palme prämierten Films Paris, Texas. Sohrab Shahid Saless drehte 1979 den Dokumentarfilm Die langen Ferien der Lotte H. Eisner, in dem sie ausführlich über ihr Leben berichtet.